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(資料圖)

MicroRNA通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)和基因組穩(wěn)定性在生物體內(nèi)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要作用。最近的數(shù)據(jù)表明，利用二代測(cè)序方法從生物體液中高通量定量miRNAs為發(fā)現(xiàn)各種疾病的生物標(biāo)志物帶來(lái)了希望，這也將有助于促進(jìn)癌癥的早期診斷。然而，復(fù)雜的測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程往往會(huì)引入偏倚，并可能掩蓋miRNA的實(shí)際表達(dá)水平，從而導(dǎo)致錯(cuò)誤性的結(jié)論。

近日，北京化工大學(xué)許立達(dá)教授課題組在Quantitative Biology期刊上發(fā)表了題為“The methodological challenge in high-throughput profiling and quantifying microRNAs”的綜述文章（點(diǎn)擊文末“閱讀原文”下載PDF全文）。文章詳細(xì)討論了miRNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中各步驟的偏倚問(wèn)題，并提出了多種策略以避免或最小化偏倚，從而生產(chǎn)高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。此外，文章還對(duì)多種市售的miRNA文庫(kù)制備試劑盒進(jìn)行了比較。希望本文能為高通量定量分析microRNA的初學(xué)者提供幫助。

全文概要

本文首先系統(tǒng)總結(jié)了在高通量分析和定量miRNAs過(guò)程中所引進(jìn)的不同來(lái)源的偏倚以及優(yōu)化步驟，并從miRNA文庫(kù)制備的每個(gè)步驟進(jìn)行了討論（如圖1）。

由于cDNA文庫(kù)制備的眾多步驟可能是結(jié)果偏倚的來(lái)源，因此研究人員傾向使用多種優(yōu)化方法建立高質(zhì)量的測(cè)序文庫(kù)，以確保高通量分析和定量microRNA結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文介紹了幾種具有代表性的組合優(yōu)化策略，如TEsR（target enrichment of sRNAs）方法通過(guò)引入生物素修飾的RNA探針、優(yōu)化接頭及使用連接酶來(lái)確保稀有sRNAs的檢測(cè)及可用的多種形式的sRNAs，但該方法不適合新型sRNAs的研究。QsRNA-seq（Quantitative small RNA sequencing）使用了優(yōu)化的SPRI和5‘接頭，以及由8個(gè)隨機(jī)核苷酸組成的UMIs，可以非常準(zhǔn)確、全面地定量miRNA。Small-seq與傳統(tǒng)方法相比，它主要是采用了寡核苷酸修飾的rRNA來(lái)避免高豐度5.8SrRNA的干擾；lambda外切酶可減少接頭二聚體的形成；5‘接頭UMI可去消除PCR擴(kuò)增和small RNA分子定量的偏倚，但該方法的偏差會(huì)來(lái)自3’接頭末端。AQ-seq（accurate quantification by sequencing）方法通過(guò)組合應(yīng)用4個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸和在3‘ 接頭和5‘接頭連接反應(yīng)中使用20% PEG，可顯著提高miRNA的量，并能檢測(cè)到低豐度的miRNA。RealSeq-AC方法通過(guò)連接一個(gè)單端的3’接頭及環(huán)化miRNA-接頭連接產(chǎn)物，從而提高了miRNA定量的準(zhǔn)確性。該方法還設(shè)計(jì)了一種阻斷分子阻止了接頭的自身環(huán)化，從而可從1ng總RNA樣品中檢測(cè)到miRNA。

此外，本文還將市售的一些low-input miRNA文庫(kù)制備的特點(diǎn)進(jìn)行了對(duì)比，如表1。

希望本文對(duì)miRNA文庫(kù)構(gòu)建的初學(xué)者在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、試劑盒購(gòu)買及如何避免實(shí)驗(yàn)偏倚問(wèn)題提供幫助。

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