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MicroRNA通過調(diào)控基因表達和基因組穩(wěn)定性在生物體內(nèi)及信號轉(zhuǎn)導途徑中發(fā)揮著重要作用。最近的數(shù)據(jù)表明，利用二代測序方法從生物體液中高通量定量miRNAs為發(fā)現(xiàn)各種疾病的生物標志物帶來了希望，這也將有助于促進癌癥的早期診斷。然而，復雜的測序文庫構(gòu)建過程往往會引入偏倚，并可能掩蓋miRNA的實際表達水平，從而導致錯誤性的結(jié)論。

近日，北京化工大學許立達教授課題組在Quantitative Biology期刊上發(fā)表了題為“The methodological challenge in high-throughput profiling and quantifying microRNAs”的綜述文章（點擊文末“閱讀原文”下載PDF全文）。文章詳細討論了miRNA測序文庫構(gòu)建過程中各步驟的偏倚問題，并提出了多種策略以避免或最小化偏倚，從而生產(chǎn)高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。此外，文章還對多種市售的miRNA文庫制備試劑盒進行了比較。希望本文能為高通量定量分析microRNA的初學者提供幫助。

全文概要

本文首先系統(tǒng)總結(jié)了在高通量分析和定量miRNAs過程中所引進的不同來源的偏倚以及優(yōu)化步驟，并從miRNA文庫制備的每個步驟進行了討論（如圖1）。

由于cDNA文庫制備的眾多步驟可能是結(jié)果偏倚的來源，因此研究人員傾向使用多種優(yōu)化方法建立高質(zhì)量的測序文庫，以確保高通量分析和定量microRNA結(jié)果的準確性。本文介紹了幾種具有代表性的組合優(yōu)化策略，如TEsR（target enrichment of sRNAs）方法通過引入生物素修飾的RNA探針、優(yōu)化接頭及使用連接酶來確保稀有sRNAs的檢測及可用的多種形式的sRNAs，但該方法不適合新型sRNAs的研究。QsRNA-seq（Quantitative small RNA sequencing）使用了優(yōu)化的SPRI和5‘接頭，以及由8個隨機核苷酸組成的UMIs，可以非常準確、全面地定量miRNA。Small-seq與傳統(tǒng)方法相比，它主要是采用了寡核苷酸修飾的rRNA來避免高豐度5.8SrRNA的干擾；lambda外切酶可減少接頭二聚體的形成；5‘接頭UMI可去消除PCR擴增和small RNA分子定量的偏倚，但該方法的偏差會來自3’接頭末端。AQ-seq（accurate quantification by sequencing）方法通過組合應用4個簡并核苷酸和在3‘ 接頭和5‘接頭連接反應中使用20% PEG，可顯著提高miRNA的量，并能檢測到低豐度的miRNA。RealSeq-AC方法通過連接一個單端的3’接頭及環(huán)化miRNA-接頭連接產(chǎn)物，從而提高了miRNA定量的準確性。該方法還設計了一種阻斷分子阻止了接頭的自身環(huán)化，從而可從1ng總RNA樣品中檢測到miRNA。

此外，本文還將市售的一些low-input miRNA文庫制備的特點進行了對比，如表1。

希望本文對miRNA文庫構(gòu)建的初學者在實驗設計、試劑盒購買及如何避免實驗偏倚問題提供幫助。

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